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Expresión diferencial de genes en los tumores de ovario revela DUSP 4 y Serpina 5 como reguladores clave de comportamiento benigno de seroso borderline RESUMEN Los tumores tumores Propósito de ovario seroso borderline (SBT) se caracterizan por arboriforme papilas revestida por células epiteliales estratificadas, variando atipia, y ausencia de invasión del estroma . Originalmente, estos tumores se han clasificado como límite porque se comportaban de una manera notablemente indolente, incluso con depósitos tumorales generalizados llamados implantes y la presencia de afectación ganglionar. La biología molecular de las lesiones acaba de comenzar a ser explorado. La alta prevalencia de mutaciones de B-RAF / K-RAS en SBTs en contraste con carcinomas serosos (SCA) indica que la quinasa vía RAS-RAF-MEK-ERK-MAP mitogénica es crucial para la patogénesis de SBT. El propósito de este estudio fue desentrañar aún más las vías genéticas a través del cual se desarrollan SBTs, con un enfoque especial en la explicación del comportamiento generalmente benigna SBT. Materiales y Métodos Se generaron perfiles de expresión de ARN de 38 tumores serosos de ovario. Se realizó análisis de vías Global Test y análisis de la importancia microarrays (SAM) de los perfiles de expresión. Resultados SAM y Pruebas Global mostraron que aunque la vía mitogénica se activa en SBTs, la activación de genes aguas abajo implicadas en la degradación de la matriz extracelular (ECM) está ausente, lo que sugiere un desacoplamiento de los dos eventos. Además, se muestra que dos genes implicados en la regulación de este desacoplamiento, ERK-inhibidor DUSP 4 y UPA-inhibidor Serpina 5. están regulados a la baja en el SCA en contraste con SBT. En SCAs, esto se asoció con aguas abajo activación de MMP-9 en ambos ARNm y proteínas. Conclusión Proponemos que los genes supresores de tumor putativo DUSP 4 y 5 Serpina proporcionan una pista importante para el comportamiento indolente de SBTs. INTRODUCCIÓN El cáncer de ovario representa el tumor más letal del tracto genital femenino porque la mayoría de los casos se diagnostican en una fase avanzada. Más de 80 de los tumores malignos de ovario son de origen epitelial. La gran mayoría de los carcinomas son serosa y surgen a partir del epitelio superficial del ovario. tumores borderline seroso (SBT) pertenecen a un grupo intermedio entre los tumores benignos y malignos. Se caracterizan por papilas fibroso múltiple con extensa y compleja ramificación jerárquica. Las células epiteliales que cubren las papilas están llenas y forman mechones celulares de varias capas. Las células epiteliales en general, muestran solamente leve a moderada atipia nuclear. 1, 2 Una variante dentro SBTs que se pueden encontrar consiste en un patrón micropapilar superficie (variante micropapilar MP-SBT). Esta variante no se ha descrito en un gran número de casos con los datos de seguimiento a largo plazo y su significado no está claro aún. 1 SBTs se clasificaron originalmente como lesiones borderline porque parecía que había una discrepancia importante entre la presentación clínica y el comportamiento. A pesar de que 30 de los pacientes se presentan con SBT depósitos tumorales llamados implantes peritoneales en superficies de grasa omental y, en 7 a 23 de los casos, incluso en los ganglios linfáticos de la supervivencia de 10 años, en general, sigue siendo excelente. 1 -3 Desde un punto de vista clínico, esto es incompatible con la enfermedad metastásica, que conduce a la clasificación de límite. Aunque favorable en la mayoría de los casos, el comportamiento biológico del SBTs difiere de la de los tumores benignos, obviamente, del mismo tipo celular. 4 muertes relacionados con el tumor en pacientes SBT son típicamente asociados con el desarrollo de implantes peritoneales invasivos, que se producen en tan sólo 4 a 13 de los pacientes con enfermedad en estadio alto. 1 -3 estudios de biología del tumor de SBTs están en curso. Recientemente, nosotros y otros han identificado mutaciones activantes en B-RAF o K-RAS. ambos miembros de la vía ERK quinasa MAP en 60 de los SBTs en contraste con menos de 12 en los carcinomas serosos (SCA). 5, 6 activación de la ruta quinasa RAS-RAF-MEK-ERK-MAP mitogénica activa constitutivamente la expresión de uPA y uPAR con la posterior conversión de la proenzima plasminógeno en plasmina. La plasmina puede activar ahora formas latentes de metaloproteasas de la matriz (MMPs). lo que resulta en la degradación de moléculas de la matriz extracelular (ECM) y la promoción de la invasión del intersticio tejido sano por las células tumorales. 7 Para desentrañar aún más el mecanismo patogénico de la tumorigénesis seroso borderline, con un enfoque especial en la explicación de su comportamiento en benigna en general, se realizó ARNm de perfiles de expresión de 11 SBTs y dos MP-SBT, 10 de bajo grado (SCA I), y 15 de alto - Grado carcinomas (SCA III) utilizando chips de Affymetrix matriz de enfoque (Santa Clara, CA). pruebas Global y el análisis de la importancia microarrays (SAM) indica que en SBTs a pesar de una vía mitogénica activado, la degradación de ECM aguas abajo está ausente debido a la presencia de la quinasa del receptor extracelular (ERK) inhibidor DUSP 4 y la de uPA inhibidor Serpina 5. Materiales y métodos Muestras de Tejido Un total de 38 muestras de tumores, se congelaron extirpados quirúrgicamente se recuperaron del banco de tumores del Departamento de Patología de la Universidad de Leiden Centro Médico (Leiden, Holanda). La junta de revisión institucional local aprobó el uso de material de tejido humano para la investigación. El panel incluyó a 11 SBTs y dos relacionados MP-10 SBTS SCA, de grado I y 15 SCA, grado III. Los diagnósticos de todos los casos fueron confirmados por dos patólogos (GJFNS) tanto en la rutina de 3 m hematoxilina (KLINIPATH, Duiven, Holanda) y eosina (Merck, Darmstadt, Alemania) se desliza a partir de material incluido en parafina y 4 m de secciones congeladas material. Dentro de cada grupo, se seleccionaron un número de tejidos como muestras de control interno. Se incluyeron nueve repeticiones técnica (seis constaba de dos conjuntos del mismo bloque de tejido y tres consistió en replicar las muestras generadas por dividir las muestras después de la extracción de RNA total), por lo tanto, se generan 47 muestras para la hibridación. los perfiles de expresión de ARNm de 1.000 genes que muestran la mayor variación entre los 47 muestras de 38 tumores serosos fueron analizados utilizando el software de visualización Spotfire (Spotfire, Somerville, MA) por la agrupación jerárquica sin supervisión utilizando el método del grupo de pares no ponderados con la media aritmética método de agrupamiento (UPGMA) con de correlación como una medida de distancia. Las repeticiones técnica agruparon inmediatamente adyacentes entre sí, mientras que la ramificación cerca de los puntos finales, lo que subraya la reproducibilidad del sistema de Affymetrix (figura 1). Para los análisis posteriores, se promediaron los valores de expresión de las repeticiones para cada muestra. dendograma muestra de agrupamiento jerárquico no supervisado de 47 muestras, incluyendo nueve repeticiones técnica. La agrupación jerárquica utilizando el método del grupo de pares no ponderados método de media aritmética (UPGMA) con correlación como una medida de distancia con. En el mapa de calor, cada fila representa un tumor y cada columna un solo gen. Nueve técnicos repeticiones (R) se representan en las barras de colores. Seis consistió en dos conjuntos de la misma bloque de tejido (06-R, 30-R, 35-R, 11-R, 24-R, y 33-R) tres consistió en muestras replicadas generadas por dividir las muestras después de la extracción de ARN total ( 31-R, R-04 y 01-R). Estas repeticiones técnica agruparon inmediatamente adyacentes entre sí, mientras que la ramificación cerca de los puntos finales, lo que subraya la reproducibilidad del sistema de Affymetrix (Santa Clara, CA). Aislamiento de ARN, ARNc de síntesis, y perfiles de expresión génica El porcentaje de células tumorales se estimó mediante un examen visual de las secciones congeladas de 5 m teñidas con HE,. Para cada bloque de tejido congelado, se seleccionaron áreas que contenían al menos 60 células tumorales viables. Zonas que constan de estroma celular se eliminaron del bloque por macrodissection, para enriquecer en células epiteliales. Posteriormente, una sección de m-5- manchada que estaba preparado para verificar el contenido del tumor después de macrodissection y 30 diapositivas de tejidos de 30 m se cortaron, seguido por una sección adicional de 5 m con tinción de HE para verificar el contenido del tumor de nuevo. Todo el procedimiento se llevó a cabo por uno de los patólogos (N. S.) para asegurar la selección óptima de las células tumorales. Debido a estos estrictos criterios de selección de entrada, más de 75 de los bloques de tejido congelado que se seleccionaron inicialmente no pudieron ser incluidos en este estudio. De los casos incluidos, el ARN total fue extraído a partir de diapositivas de tejido congelado con Trizol (Life Technologies Inc, Carlsbad, CA) y se purificó usando columnas de centrifugación RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). La integridad y la cantidad del ARN total y el cRNA marcado se evaluó mediante análisis espectrofotométrico y en el Agilent 2100 Bioanalyzer conductor usando RNA 6000 Nano Assay Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada vez que este análisis mostró resultados menos que óptimos, el caso fue eliminado del estudio. Se utilizó 20 g de ARN total para sintetizar ADNc de doble cadena con el sistema SuperScript Choice (Life Technologies, Rockville, MD). Después de purificar el cDNA resultante con el módulo de limpieza de la muestra de Gene Chip (Affymetrix, Santa Clara, CA), se aplicó el ADNc como molde para la transcripción in vitro con el RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnóstico Inc, Farmingdale, NY). integridad y cantidad cRNA se midieron como se describe para el RNA total y otra vez, cada vez que esta prueba indica condiciones subóptimas, el caso no proceder con el paso siguiente. Posteriormente, el cRNA marcado se purificó usando las columnas previstas en el módulo de limpieza de la muestra de Gene Chip (Affymetrix) y fragmentadas por tampón de fragmentación 5 RNA. Por último, se hibridó 20 g de cRNA marcado en alta sensibilidad de oligonucleótidos chips de micro matriz (array enfoque genoma humano, Affymetrix, www. affymetrix. com/products/arrays/specific/focus. affx) a 45ºC durante 16 horas. Los arreglos fueron analizados utilizando un escáner de Gene Array (Affymetrix), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizaron 8 B-RAF / K-RAS análisis de mutaciones Todos los casos de mutaciones en K-RAS. exón 1 por una reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR) basado en la aproximación y la mutación V599E B-RAF común en el exón 15 por secuenciación directa como se informó anteriormente. Procesamiento de datos 6 para el preprocesamiento Análisis estadístico de datos consistió en el análisis robusto multichip normalización (RMA), debido a su excelente rendimiento, especialmente cuando la correlación de los técnicos replicar arrays. 9, 10 Este método produce normalizados log 2 valores de expresión transformados para cada conjunto de sondas en una matriz. Análisis estadístico de Expression Arrays Dado que en las mutaciones de SBT en B-RAF y K-RAS (ambos miembros de la quinasa vía RAS-RAF-MEK-ERK-MAP) son muy prevalentes, estudiamos el activada por mitógenos proteína quinasa ERK1 / Erk2 ( MAPK) vía de señalización (software BioCarta, San Diego, CA, http://cgap. nci. nih. gov/Pathways/BioCartaPathways) en el análisis de pruebas globales. De los 28 genes enumerados, 22 estaban disponibles en el chip de enfoque matriz. La prueba global se ha desarrollado específicamente para probar la influencia de las condiciones experimentales en grupos relacionados funcionalmente de variables aleatorias en los conjuntos de datos de alta dimensión, como los datos de microarrays de expresión génica. Esencialmente, se basa en un modelo lineal generalizado bayesiano empírico, donde los coeficientes de regresión entre los datos de expresión y el resultado clínico son las variables aleatorias. La prueba se aplica una prueba de bondad de ajuste en este modelo mediante la combinación de la influencia de los genes separados en un solo examen para el grupo de genes. 11 Dado que en la presencia de una quinasa vía RAS-RAF-MEK-ERK-MAP mitógeno activada, se espera una producción de proteasa mejoradas, tales como UPA y MMP, también seleccionaron los nueve genes BioCarta implicadas en la degradación de ECM aguas abajo de UPA en el Mundial Prueba. 7 Además, hemos utilizado SAM para identificar genes expresados ​​diferencialmente en el grupo de SBT y SCA. 12 SAM utiliza modificado estadísticas de la prueba t para cada gen de un conjunto de datos. Un pequeño factor de elusión se añade al denominador en el cálculo del valor de t, controlando de esta manera para irrealmente bajas desviaciones estándar en la prueba de genes. Además SAM permite el control de la tasa de falso descubrimiento (FDR) mediante el establecimiento de un umbral para la diferencia entre el resultado de la prueba real y el resultado de repetidas permutaciones de los grupos de prueba. MMP-9 Actividad por Zymography activa MMP-9 se visualizó usando zimografía de gelatina para los 38 tumores serosos, tal como se describe en otro lugar. 13 Diez microgramos de proteína por muestra se cargó en el gel, y depende de la intensidad de las bandas, la cantidad de proteína para cada una de las muestras se ajustó a 2,5 g, 5 g, o 10 g de proteína en una segunda ejecución. Quantitative PCR de la transcriptasa inversa para DUSP 4 y 5 Serpina Dos microgramos de RNA se transcribe inversa con el virus de la leucemia murina de Moloney la transcriptasa (Invitrogen, Breda, Países Bajos) siguiendo las instrucciones del fabricante inversa. En tiempo real la transcriptasa inversa (RT) PCR se llevó a cabo en aproximadamente 30 ng de ADNc en un ABI PRISM 7700 Sequence Detection System aparato (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en un volumen de 25 l que contiene 1qPCR Mastermix ventaja para SYBR Green I (Eurogentec, Lieja, Bélgica) y 400 nmol / L de la cebadores directo e utilizando el siguiente perfil de PCR inversa: 10 minutos a 95ºC, seguido de 50 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC. Los cebadores utilizados para tiempo real RT-PCR fueron dirigidos contra DUSP 4. Serpina 5. actina y la ciclofilina A. Las secuencias de cebadores para el gen diana DUSP 4 eran 5-CAAAGGCGGCTATGAGAGGTT-3 y el 5-CCAGGTCCAAGGGCTCTGTG-3 para Serpina 5. 5-CGGTCGTGATCATGGTGAATTAC-3 y 5-CGAGGTCACGTAGAAGTCTTGCTC-3. La sensibilidad de todos los conjuntos de cebadores se confirmó en una serie de dilución de cDNA total derivado de un carcinoma de ovario. Cada par de cebadores tenía una tasa de amplificación lineal dentro de la pendiente prevista de aproximadamente -3,3, hasta 0,05 ng de cDNA total. El ciclo umbral parámetro se define como el ciclo en el cual la señal fluorescente pasa un valor fijo, y la expresión de los genes diana se normalizó a la expresión de la ciclofilina A del gen de control. RESULTADOS agrupación jerárquica (sin supervisión y en relación con B-RAF / K-RAS estado de mutación) Agrupación jerárquica sin supervisión (figura 2 mostraron que los 11 SBTs y los dos relacionados con MP-SBTs genera un apretado racimo completamente independiente de todos menos uno (NS21) de la SCA. el grado I y III SCA no podía separarse aún más en grupos identificables (figura 2). K-RAS y análisis de la mutación B-RAF mostraron que cinco SBTs albergaban un K-RAS codón 12-13 mutación, cinco SBTs albergaban el V599E común B-RAF mutación y una SBT (NS16) no tenían la mutación (Fig 2). Ninguno de los SBTs tenía mutaciones tanto en K-RAS y B-RAF. concordante con publicaciones anteriores, todos los SCAs fueron negativos para B - mutaciones de la RAF y mostraron una baja prevalencia de K-RAS mutaciones codón 12-13 (dos mutaciones en el grupo SCA I y tres mutaciones en el grupo SCA III). de los casos restantes, se detectó una mutación K-RAS en un MP - SBT (figura 2). la inclusión del estado de la mutación K-RAS y B-RAF no influyó en los resultados de la agrupación. Sin supervisión análisis jerárquico de clúster de 38 tumores de ovario y B-RAF / K-RAS estado de mutación La agrupación jerárquica utilizando el método del grupo de pares no ponderados método de media aritmética (UPGMA) con correlación como una medida de distancia con. En el mapa de calor cada fila representa un tumor y cada columna un solo gen. El color rojo indica mayor a la media de la expresión y el verde indica la expresión más baja de lo normal. mutaciones K-RAS y B-Raf se indican con en 2 columnas Los tipos de tumores se han coloreado para facilitar la identificación de los grupos, mientras que el dendrograma muestra la proximidad de las muestras. SCA, carcinoma seroso SBT, tumor seroso borderline, MP-SBT, patrón micropapilar SBT. Análisis Global Test alta prevalencia de mutaciones de B-RAF y K-RAS en SBTs, observada en el presente estudio, así como en estudios previos, argumenta fuertemente a favor de las vías quinasa RAS-RAF-MEK-ERK-MAP siendo crucial para SBT tumorigénesis en la mayoría de los casos. Para desentrañar aún más el fondo molecular de SBT, se realizó un análisis de Prueba Global para el Erk1 / Erk2 señalización MAPK vía de los genes y los genes que se sabe están involucrados en la degradación de ECM aguas abajo de UPA. Para el RAS-RAF-MEK-ERK-MAP quinasa vía de señalización, la Prueba Global mostró que el SBTs y los SCAs fueron significativamente diferentes (P 4.4 10 5). En línea con la presencia de mutaciones activadoras B-RAF / K-RAS en 10 de 11 SBTs, parcelas de genes para la RAS-RAF-MEK-ERK-MAP quinasa vía de señalización indican la regulación al alza constante en los SBTs en comparación con SCA. No se pudo observar diferencia para SCAs I versus SCAs III. Análisis Global Test de genes implicados en la regulación de la degradación de ECM mostró que SBTs y SCA fueron significativamente diferentes (v SBTs SCA, P 4.8 10 5). Sin embargo, las parcelas de genes indican regulación a la baja de todos menos uno (inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1 TIMP1. Un inhibidor de MMP de origen natural) MMPs en SBTs compararon con SCA. MMP-9 mRNA y de la actividad Zymography Para explorar la relevancia de los resultados presentados por la prueba global, nos hemos centrado en mayor detalle en los nueve genes implicados en la degradación de ECM. Analizar las diferencias en la expresión de mRNA revelaron que la MMP-9 era 2,1 veces la disminución en SBTs en comparación con el SCA. Para las otras MMP, se encontró que el inhibidor de MMP TIMP3 fue 2,4 veces mayor en comparación con el SCA SBTs. Además, la expresión de ARNm media de la TIMP1 inhibidor era 1,6 veces mayor en el SBT. No se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión de las MMP seis restantes (Tabla 1). 95 elementos de configuración para los valores medios de microarrays de expresión siguientes datos RMA preprocesamiento (incluye log 2 transformación) Para estudiar la relevancia biológica de las diferencias observadas en los niveles de expresión de genes implicados en la degradación de ECM, se realizó la MMP-9 zimografía para evaluar la presencia de funcionalmente activo MMP-9. MMP-9 activa estaba presente en todos los SCA etapa III, y todos menos dos (NS21, NS38) de la etapa I SCA (figura 3). metaloproteasas de la matriz 9 (MMP9) zimografía. Cuatro ejemplos representativos de zimografía de gelatina para MMP-9 y MMP-2 de detección. Los mejores bandas representan la MMP-9 (proMMP-9, banda superior activa MMP-9, segunda banda de arriba), y las bandas inferiores representan la MMP-2 (todo consiste en proMMP-2). carcinomas serosos (SCA) contienen tanto proMMP-9 (92 kDa) y activados MMP-9 (86 kDa carriles 2 y 4) en contraste, los tumores borderline serosas (SBTS) contienen solamente proMMP-9 (carriles 1 y 3). Ninguno de los casos contenía activa MMP-2. SAM, DUSP 4 y 5 Serpina Los resultados hasta ahora indican que, en SBTs existe un desacoplamiento entre una quinasa vía RAS-RAF-MEK-ERK-MAP activada y la posterior señalización que conduce a la degradación de ECM por la sobreexpresión de uPA y MMP aguas abajo. Por lo tanto, nos hemos centrado en desentrañar el mecanismo molecular que podría explicar lo que restringe estos tumores con sobreexpresión de proteasas asociadas al tumor a pesar de una señal mitogénica activado, razonando que esto podría explicar el comportamiento borderline indolente típico. 12 A partir de una lista SAM de genes expresados ​​diferencialmente entre SBTs y SCA, se identificaron DUSP 4 y 5 Serpina como candidatos que podrían explicar este desacoplamiento en SBTs. DUSP 4 (MKP 2) es un inhibidor de ERK y Serpina 5 (PAI 3) es un inhibidor de UPA. Ambos genes se downregulated constantemente en el SCA en comparación con el SBTs. La expresión de ARNm media DUSP 4 de SCA fue de 3,1 veces disminuyó en comparación con el SBT. El Serpina 5 expresión media ARNm para SCAs era 5,3 veces disminuyó en comparación con SBTs (Tabla 1). La media de los valores de expresión de ARNm para DUSP 4 y 5 Serpina en el MP-SBTs estaban entre los valores medios de SBT y de la SCA. Los datos de microarrays en DUSP 4 y 5 Serpina fueron corroboradas por los 38 casos por RT-PCR ensayos cualitativos (Figura 4). Cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (Q-RT-PCR) DUSP 4 y Serpina 5 Confirmación de microarrays (MA) Resultados por Q-RT-PCR para los tumores borderline seroso (SBTs n 11), la etapa I carcinomas serosos (SAC 1 n 10 ), y la etapa III SCA (n 15). SE microarrays de expresión como log 2 valores de intensidad se representa por las barras amarillas. la expresión Q-RT-PCR ED como valores DCT se representa por las casillas negras. Ambos indicadores pueden interpretarse como medidas de la expresión logarítmica. Ambos (A) Serpina 5 (P 1,8 10 6) y (B) DUSP 4 (P 8.5 10 5) la expresión del ARNm es significativamente diferente entre SBT y SCA. Además el patrón de expresión entre los tres tipos de tumores está estrechamente imitó con ambos métodos. DISCUSIÓN La distinción entre SBTs y SCA es uno de los problemas más comunes en la patología tumoral de ovario, sin embargo, la literatura sobre los tumores borderline es confuso, sobre todo en lo que respecta a sus características de diagnóstico y tratamiento. 4 A continuación, presentamos pruebas en el fondo molecular del comportamiento indolente de SBTs sobre la base de perfiles de expresión de 38 tumores serosos de ovario. Además, los resultados indican que SBTs y SCAs representan entidades patogénicos separadas. Agrupación jerárquica sin supervisión mostró que todos los SBTs y relacionados MP-SBT, generó un apretado racimo completamente independiente de todos menos uno (NS21) de la SCA, lo que indica que SBTs y SCA representan entidades separadas patogénicos. La agrupación de la MP-SBT dentro del grupo de SBTs suscribe que este subtipo es una variante morfológica de SBT, que se ha sugerido en base a la similitud en el perfil genético molecular de estos tumores. 6 Nuestros datos están de acuerdo con un reciente trabajo de Gilks ​​y otros, que también muestra la separación completa de SBT y SCA. 14 Por el contrario, Meinhold-Heerlein et al describen similitudes entre SBT y SCA de bajo grado y no pudieron identificar grupos separados de SBT y SCA. 15 En los últimos años, ha habido un cambio en el enfoque del estudio de los efectos de los genes individuales a efectos de múltiples genes relacionados funcionalmente, estudiando. La mayoría de los métodos actuales para el estudio de las vías de implicar el examen de un aumento de la proporción de genes expresados ​​diferencialmente en las vías de interés y probar esto ya sea la realización de una prueba de 2 o una prueba exacta de Fishers. Estos métodos no se identifican las vías donde muchos genes han alterado su expresión en una forma pequeña. La prueba global fue diseñado para tratar este tema. 11 Pruebas de Global mostró que aunque la vía mitogénica se activa en SBTs, la activación de genes aguas abajo implicadas en la degradación de ECM está ausente, lo que sugiere un desacoplamiento de los dos eventos. Esto se fundamenta en la constatación de que en SBTs el valor de la expresión del ARNm de MMP-9 fue 2,1 veces disminuyó en comparación con SCA, que fue confirmado en un nivel biológico por MMP-9 zimografía. Nuestros hallazgos sobre MMP-9 están de acuerdo con informes anteriores que indican que el aumento de expresión de MMP-9 se correlaciona con el potencial maligno de los tumores ováricos. 16 Por otra parte, para el SBT, estos resultados encajan perfectamente en el comportamiento borderline benigna, ya que la presencia de proteasas asociados a tumores activar no está de acuerdo con SBT la biología del tumor que carece de la invasión del estroma destructiva. Por lo tanto, se hizo cada vez más evidente que los genes reguladores implicados en desacoplar la vía mitogénica y genes aguas abajo implicado en ECM podrían explicar cómo una enfermedad con características patológicas que sugiere malignidad se comporta de una manera generalmente no progresiva. SAM análisis identificó dos genes implicados en la regulación de este desacoplamiento es decir, el inhibidor de ERK DUSP 4 y UPA inhibidor Serpina 5. que son tanto downregulated en SCA en contraste con SBT. DUSP 4 ARNm se expresa en niveles moderados en casi todos los tejidos y células y codifica una fosfatasa que inactiva MAPK in vitro y la transcripción de genes dependiente de MAPK en vivo. 17 En las células sanas en desarrollo, fosfatasas MAPK (MKPs) como DUSP 4 dictar la elección de la diferenciación o la proliferación. La correlación de DUSP 4 expresión y la falta de la activación de ERK en un cáncer humano se demostró primero para los tumores pancreáticos que, como SBTs, con frecuencia albergan mutaciones K-RAS. 18 Recientemente, DUSP 4 se presentó como un candidato gen supresor tumoral en el cáncer de mama 19 y Wang et al correlaciona los pacientes con cáncer de mama que tienen un pronóstico favorable con una firma genética que incluye DUSP 4. 20 El segundo gen supresor tumoral putativo identificamos se Serpina 5 (inhibidor de proteína C), que es un miembro de la superfamilia de inhibidores de serina proteasa incluyendo alfa-1-antiquimotripsina alfa-1-antitripsina, antitrombina III, y angiotensinógeno. Serpina 5 fue aislado por primera vez a partir de plasma humano. Funciona como un inhibidor de varias proteasas plasmáticas implicadas en la coagulación de la sangre y es un potente inhibidor de UPA. Cantidades significativas de Serpina 5 mRNA se han detectado en numerosos tejidos, incluyendo el ovario. 21 Teniendo en cuenta tanto el papel de UPA en la metástasis de células tumorales y su inhibición por Serpina 5. la relevancia fisiológica de Serpina 5 en la metástasis de las células tumorales es evidente. 21 La importancia de Serpina 5 como un potencial gen supresor de tumores a través de la inhibición de proteasas de serina es subrayada por Michael et al, que los miembros asociados de las calicreínas de tejidos humanos (KLK) de la familia, que consta de 15 genes de la serina proteasa homólogos, con diferentes tipos de cáncer . 22 Además, estudios recientes han demostrado que KLK5 está regulada diferencialmente en una variedad de tumores malignos dependientes de hormonas, incluyendo ovario, mama, próstata y cáncer testicular. De acuerdo con los resultados presentados en el presente estudio, se encontró una fuerte asociación entre la presencia de la expresión KLK5 y formas más agresivas de cáncer de ovario epitelial, aumentaba el riesgo de recaída y muerte. 23 Esto se fundamenta en un informe sobre el cáncer de próstata en el que se encontró pérdida de Serpina 5 expresión en tumores de alto grado. 24 La evidencia adicional que se presenta un informe sobre el efecto de la MEK1 / -2 inhibición de ovario por CI-1040. 25 Este estudio muestra que en líneas celulares de carcinoma de ovario, la inactivación de los resultados de MAPK en una inhibición del crecimiento marcada en los tumores con mutaciones en K-RAS o B-RAF, en contraste con sólo un efecto modesto en los tumores de tipo salvaje de K-RAS y B-RAF. Estos resultados apoyan que desacoplar un mitogénica RAS-RAF-MEK-ERK-MAP quinasa y la activación de ECM activa proporciona una pista importante para el comportamiento indolente SBT. Nuestras observaciones, lo que indica que se cree que las mutaciones en el K-RAS o oncogén B-RAF ser insuficiente para inducir un fenotipo maligno, no son únicos para SBTs. Los estudios que examinan las mutaciones K-RAS como un evento iniciador en la transformación celular se han visto obstaculizados por la observación de que RAS mutante induce senescencia primario, que se ha atribuido a la hiperestimulación crónica de la cascada de MAPK. 26 Ejemplos ilustrativos se presentan en el colon, donde se conocen los pólipos hiperplásicos y adenomas de albergar la activación de mutaciones en B-RAF o K-RAS en más de 80 de los casos, y sólo una pequeña fracción de los progresos hacia la malignidad. 27 Estos resultados indican que se necesitan eventos genéticos adicionales para desarrollar un fenotipo francamente malignas. Para SBTs, sigue siendo intrigante cómo se produce la progresión de la enfermedad en un nivel genético molecular por el desarrollo de los implantes (auto) invasivos. Suponiendo una función reguladora clave de DUSP 4 y 5 Serpina, es razonable especular que la invasión del estroma destructiva puede estar relacionada con la pérdida de la inhibición de ERK y UPA. Aunque la presentación de la prueba sólida se ve obstaculizada por la baja prevalencia de los implantes invasores, incluimos un caso implantes invasivos en el presente estudio matriz. Además de una mutación B-RAF, encontramos para este caso suprime los valores de expresión de ARNm de DUSP 4 y 5 Serpina si se compara con el valor medio SBT. Estos datos han sido confirmados por RT-PCR cualitativa También, en este caso progresiva MMP-9 mRNA estaba en el intervalo de la SCA, y zimografía confirmado la presencia de MMP-9 activa (datos no mostrados). En conclusión, se presenta una fuerte evidencia de que los inhibidores de ERK DUSP 4 y UPA - inhibidor Serpina 5 actúan como reguladores clave candidatos responsables del comportamiento indolente SBT (figura 5). Estos genes supresores de tumor putativo actúan aunque activación desacoplamiento de la vía de la quinasa RAS-RAS-MEK-ERK-MAP y la activación de genes aguas abajo que regulan la actividad de la proteasa, tales como la MMP-9. De acuerdo con estos resultados, encontramos aguas abajo activación de MMP-9 en SCA en contraste con SBTs tanto a nivel de ARNm y proteínas. En el futuro, DUSP 4 y 5 Serpina pueden tener aplicación clínica útil en el diagnóstico de cáncer de ovario y manejo del paciente. DUSP 4 y Serpina 5 como reguladores de comportamiento benigno en los tumores borderline seroso (SBT) en presencia de un activadas RAS-RAF-MEK-ERK-MAP quinasa, la activación de la proteasa aguas abajo está ausente en presencia de ERK-inhibidor DUSP 4 y UPA inhibidor Serpina 5. lo que resulta en la falta de invasión del estroma. ECM, matriz extracelular.